长麦穗鱼(Pseudorasbora elongata)附庸于鲤形目(Cypriniformes)、鲤科(Cyprinidae)、鮈亚科(Gobioninae)、麦穗鱼属，是我国私有的袖珍鱼类。与其同属的麦穗鱼比较，长麦穗鱼的分散鸿沟极为窄小，仅分散于长江中卑劣水系的建德、石台和祁门，以及西江水系的阳朔和桂林[1-4]。长麦穗鱼对生境条件严苛，偏好清晰的缓流浅滩和卵砾石底质生境。受栖息地环境蜕变、过度捕捞等东谈主类行为的影响，长麦穗鱼野生资源量不时下跌、分散区域精真金不怕火萎缩等问题变得尤为凸起，已被《中国濒危动物红皮书：鱼类》和《中国物种红色名录(第一卷)》列为“易危”种[5-6]。凭证前期的拜谒成果及历史预计良友发现，在长麦穗鱼的历史分散区建德，现已不见陈迹，而漓江分散区在20世纪就已面对绝迹[7-8]。当今，长麦穗鱼仅在安徽境内长江流域的石台和祁门地区偶有发现。因此，对安徽长江流域现有长麦穗鱼种质资源伸开拜谒，分析并厘清其遗传种种性和遗传结构近况幼女白丝，评估其历史动态，对长麦穗鱼种质资源的保护及后续的可捏续发展极为进攻。

遗传种种性是物种糊口(稳健)和发展(进化)的前提，可反应出其进化历史及进化后劲。鱼类同其他脊椎动物雷同，其线粒体DNA (mitochondrial DNA， mtDNA)呈闭合环状，具有母系遗传、结构通俗、进化速度快等特色，是一种进攻的分子秀丽[9]。mtDNA中细胞色素b (cytochrome b， Cyt b)是预计得最为明晰的卵白质编码基因之一，其进化速度适中；而mtDNA戒指区(control region displacement loop， D-loop，又称D-环区)不参与编码卵白质，进化速度快，且与Cyt b基因在进化上存在各别[10-11]。因此，mtDNA Cyt b基因和D-loop区常看成分子秀丽被平素应用于鱼类的遗传种种性预计[12-15]。当今，已有学者对长麦穗鱼的mtDNA序列及结构作念了描述，但对其种群遗传结构及种种性未见系统报谈[16]。预计发现，长麦穗鱼在样式学上与扁吻鮈属的鱼类有诸多相似特征，而在对麦穗鱼属系统发育关系的预计中发现，长麦穗鱼是起始分化出来的一支，与本属其他种亲缘关系相对较远[17]。据此，本预计拟接受长麦穗鱼mtDNA Cyt b基因及D-loop区序列对安徽皖南山区长麦穗鱼种群遗传种种性近况和遗传结构进行分析和评估，以期为后续长麦穗鱼的系统进化、种质资源的浮松及开发利用与可捏续发展提供表面依据。

1　材料与方法 1.1　样品采集与DNA索要

长麦穗鱼样品于2018年4月至2019年12月用地笼网网罗于长江中卑劣安徽境内皖南山区的闪里(SL)、历口(LK)和石台(ST) 3地(图1)，整个141尾，取鳍条组织置于无水酒精中保存。长麦穗鱼基因组DNA依据天根生化科技(北京)有限公司动物组织基因组DNA索要试剂盒(DP304-02)进行索要，基因组DNA经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，保存于−20 ℃雪柜备用。

图1 　长麦穗鱼采样点分散图 Fig. 1 　Sampling sites of Pseudorasbora elongata 1.2　PCR扩增与测序

凭证NCBI数据库中长麦穗鱼mtDNA全序列(GenBank: KF051938)，利用Primer Premier 5.0规划引物用于Cyt b基因和D-loop区序列扩增。本预计所用扩增和测序的引物序列为，Cyt b F: 5ʹ-ATGGCAAGCCTACGAAAAACCC-3ʹ、Cyt b R: 5ʹ-AGGGCAAGCTCATTTTAGTGCTT-3ʹ; D-loop F: 5ʹ-TTAACTCCCACCCCTGGCTC-3ʹ、D-loop R: 5ʹ-CGGAGCTTTCTAGGGCCCAT-3ʹ。PCR反应体系25 μL，包含10×PCR Buffer 2.5 μL， MgCl2 2 μL， dNTP 0.5 μL， DNA模板1 μL，上、卑劣引物各0.5 μL， Taq DNA团聚酶0.5 μL， ddH2O补足体积。扩增身手：预变性94 ℃ 3 min；变性94 ℃ 30 s， 52 ℃ (Cyt b)或54 ℃ (D-loop)退火30 s， 72 ℃延长1 min; 35个轮回，72 ℃延长10 min。扩增居品历程1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，送样测序。本预计引物合成及扩增居品测序均由北京擎科生物有限公司武汉分公司完成。为保证测序准确性，系数样品均接受双向测序。

1.3　数据分析

所取得测序成果哄骗Vector NTI软件进行拼接，序列整理后在GenBank中进行比对，阐发扩增片断即为本预计意见片断。利用Clustal X2软件对测序成果进行比对，去除两头冗余序列。哄骗DnaSP 5.0软件取得基于Cyt b和D-loop序列的单倍型数(number of haplotypes， h)、单倍型种种性指数(haplotypes diversity， Hd)、核苷酸种种性指数(nucleotide diversity， π)、平均核苷酸各别指数(average number of nucleotide differences， K)以及多态位点数(number of polymorphic sites， S)[18]。使用MEGA X软件计较Cyt b基因和D-loop区序列的碱基组成、变异及保守位点、疗养与颠换比值，接受最大似然法(maximum likelihood， ML)构建系统发育进化树，各分支置信度用Bootstrap重迭检测1000次[19]。哄骗Arlequin3.5软件计较遗传分化指数(F-statistics， Fst)和分子变异分析(analysis of molecular variance， AMOVA)，基因流(Nm)由公式Nm≈(1−Fst)/4Fst计较[20-21]。哄骗中介法(median joining， MJ)构建单倍型辘集结构图(Network 5.0)。

2　成果与分析 2.1　长麦穗鱼线粒体Cyt b基因和D-loop区的序列特征

测序成果历程纠正比对后，分别取得长麦穗鱼Cyt b基因序列1046~1049 bp和D-loop序列938~941 bp。通过MEGA X软件计较序列碱基组成，成果裸露皖南山区3个长麦穗鱼群体间Cyt b和D-loop序列4种碱基A、T、G、C的平均含量分别为28.5%、32.3%、13.8%、25.4%和33.9%、34.0%、12.9%、19.2% (表1)，两序列均出现赫然AT偏移，A+T (60.8%、67.9%)高于G+C (39.2%、32.1%)，合乎已知鱼类线粒体DNA序列特征。此外，Cyt b基因4种碱基在第1、2和3位密码子分散也出现偏倚性，碱基A偏向第1位密码子(34.7%)，碱基T偏向于第3位密码子(38.8%)。Cyt b基因序列有3个碱基插入或缺失，包含50个变异位点，其中单元点突变11个，检朴信息位点39个；变异位点的疗养/颠换比为1.89，疗养以碱基C/T间为主。D-loop区序列有5个碱基插入或缺失，包含变异位点43个，包括检朴信息位点37个和单突变位点6个，变异位点的疗养和颠换比值为1.43。

表1 　长麦穗鱼线粒体Cyt b基因和D-loop区序列的碱基组成 Tab. 1 　Nucleotide composition of mtDNA Cyt b gene and D-loop region sequences of Pseudorasbora elongata 2.2　群体遗传种种性分析

使用DNAsp5对皖南山区3个地舆群体长麦穗鱼的遗传种种性参数进行分析统计，成果如表2所示。Cyt b基因在长麦穗鱼3个群体的137个个体中共检测到18种单倍型，3个群体的单倍型种种性指数(Hd)为0.275~0.721，长麦穗鱼举座Hd为0.792; 3个群体的核苷酸种种性指数(π)为0.00038~0.00172，举座为0.01332，核苷酸种种性较高。核苷酸各别数(K)在3个群体中的各别与核苷酸种种性一致。D-loop区序列在3个群体141个个体中共检测到27种单倍型，单倍型种种性指数为0.053~0.773，举座Hd为0.777；核苷酸种种性指数0.00017~0.0026，举座π为0.01140; 3个群体举座核苷酸各别数K为10.623。其中，长麦穗鱼ST群体Cyt b基因和D-loop区序列的Hd和π分别为0.275和0.00038、0.053和0.00017，均是3个群体中最低的。

2.3　群体间的遗传距离和遗传分化分析

基于K2P模子计较皖南山区长麦穗鱼群体内和群体间遗传距离(表3)。长麦穗鱼Cyt b基因的分析成果裸露，3个群体内的遗传距离为0.00038~ 0.00172，群体间的遗传距离为0.00173~0.03615；其中，ST群体内的遗传距离最小(0.00038); ST和LK间的遗传距离最大(0.03615); SL和LK间的遗传距离最小(0.00173)。基于D-loop区序列的计较成果标明，ST群体内的遗传距离最小(0.00011)， SL和ST群体间的遗传距离最大(0.02639)。

表2 　基于线粒体Cyt b基因和D-loop区序列的长麦穗鱼群体的遗传种种性参数和中性覆按 Tab. 2 　Genetic diversity and neutral test of Pseudorasbora elongata based on the sequences of mtDNA Cyt b gene and D-loop region 表3 　基于线粒体Cyt b基因和D-loop区序列的长麦穗鱼群体遗传距离 Tab. 3 　Genetic distance within/among Pseudorasbora elongata populations based on the sequences of mtDNA Cyt b gene and D-loop region

长麦穗鱼3个群体间遗传分化指数和基因流分析成果裸露(表4)，基于Cyt b基因和D-loop区序列长麦穗鱼群体间的固定指数Fst为0.10688~ 0.97247、0.05332~0.98421，并据此计较长麦穗鱼群体间的基因流Nm分别为0.00707~2.08907、0.00401~4.43867，标明3个长麦穗鱼群体间存在不同进度的遗传分化，且不毛基因疏通。相较而言，SL和LK群体间分化进度较低，ST和SL及LK群体间的遗传分化进度均较高。

国产福利小视频合集在线看 表4 　基于线粒体Cyt b基因和D-loop区序列的长麦穗鱼群体间固定指数和基因流分析 Tab. 4 　Pairwise fixation indices and gene flow among Pseudorasbora elongata populations based on mtDNA Cyt b gene and D-loop region

长麦穗鱼群体间的分子方差分析(AMOVA)成果如表5所示，基于Cyt b基因和D-loop区序列，长麦穗鱼群体间的遗传变异分别占94.60%、90.69%，群体内的遗传变异占5.40%、9.31%，裸泄漏长麦穗鱼群体间的遗传变异远高于群体内，标明长麦穗鱼的遗传变异主要来自于群体间。

2.4　单倍型分散与系统进化分析

经ClustalX软件比对，基于Cyt b基因和D-loop区序列哄骗DnaSP软件分别界说了18和27种单倍型。在Cyt b基因的单倍型中，Hap2是上风单倍型，占比高达37.2%，为SL和LK群体所共有；Hap1、Hap4、Hap7、Hap10、Hap11是SL群体私有的单倍型；Hap6、Hap8、Hap9、Hap12、Hap13为LK群体所独享；值得从容的是ST群体的5种单倍型均为该群体所私有，且Hap14是ST群体的上风单倍型(表6)。在D-loop区序列界说的单倍型中，Hap1是上风单倍型，为SL和LK群体共有；值得从容的是SL群体独享的单倍型种数高达23种，而ST群体仅有Hap26和Hap27两种单倍型，均为该群体所私有，且Hap26是ST群体的上风单倍型(表6)。以同属的麦穗鱼(Pseudorasbora parva，基因登录号：JF802126.1)及扁吻鮈属的扁吻鮈(Pungtungia herzi，基因登录号：AB239598.1)为外群，基于长麦穗鱼Cyt b基因界说的18种单倍型和D-loop区序列界说的27种单倍型，分别构建ML系统进化树(图2a、2b)。由系统进化树可知，基于Cyt b基因(图2a)和D-loop区(图2b)序列构建的两个长麦穗鱼系统发育树均可赫然地分为2个分支：一个分支由ST群体的单倍型组成；另一个分支由SL和LK群体的单倍型组成。这与上述ST和SL、LK群体间的遗传距离相对较远，群体间的遗传分化指数较高相符。另外，值得从容的是，系统进化裸泄漏长麦穗鱼与扁吻鮈聚在通盘，而不是同属的麦穗鱼，标明其与扁吻鮈的亲缘关系更近。

表5 　长麦穗鱼群体遗传各别的分子方差分析(AMOVA) Tab. 5 　Analysis of molecular variance (AMOVA) of Pseudorasbora elongata 表6 　基于线粒体Cyt b基因和D-loop区序列的长麦穗鱼3个群体的单倍型分散 Tab. 6 　Haplotype distribution in three Pseudorasbora elongata populations based on mtDNA Cyt b gene and D-loop region

基于中介法(medium-join， MJ)，哄骗Network5.0软件构建长麦穗鱼Cyt b基因和D-loop区单倍型辘集结构图。基于Cyt b基因18种单倍型构建的网格图如图3a所示，Hap2和Hap3单倍型较为陈腐，位于网格图中心位置，因3个节点而生息出来的单倍型呈辐散状分散于其周围；ST群体的上风单倍型Hap14由SL群体Hap1生息而来。基于D-loop序列27种单倍型构建的网格图如图3b，网格图举座以Hap1单倍型为中心，各群体的单倍型齐胜仗或曲折由Hap1突变后形成，呈辐散状分散于其周围。总体来看，长麦穗鱼单倍型网格图呈现的地舆分散神志与系统进化树成果访佛。

图2 　基于线粒体Cyt b基因(a)和D-loop区(b)序列的长麦穗鱼单倍型系统进化树 Fig. 2 　The phylogenetic tree based on haplotypes of Cyt b gene (a) and D-loop region (b) in Pseudorasbora elongata 图3 　基于长麦穗鱼线粒体Cyt b基因(a)和D-loop区(b)单倍型的辘集结构图 Fig. 3 　The haplotype network based on Cyt b gene (a) and D-loop region (b) in Pseudorasbora elongata 2.5　种群历史动态

将皖南山区长麦穗鱼3个群体看成举座基于Cyt b基因和D-loop区序列进行中性覆按，成果裸露Tajima’D值和Fu’s Fs值均为碰巧(表2)，且核苷酸错配分散分散图为多峰(图4d、4h)，标明皖南山区长麦穗鱼合乎中性进化假定，历史上未发生过种群蔓延。基于Cyt b基因3个群体的Tajima’D值和Fu’s Fs值均为负值，且关于ST群体来说Tajima’D值(P<0.01)和Fu’s Fs值(P<0.05)统计学分析存在各别，偏离中性覆按模子，其核苷酸错配分散图呈现单峰(图4c)，标明ST群体在历史上发生过种群蔓延；SL和 LK群体核苷酸不配对图呈现多峰(图4a、4b)，证明其未发生蔓延。基于D-loop区序列，ST群体Tajima’D值和Fu’s Fs值均为负值，且Tajima’D值统计分析中存在显赫各别(P<0.05)，其核苷酸不配对图呈单峰，也证明其历史上发生过蔓延(图4g)。而LK群体Tajima’D值和Fu’s Fs值为碰巧，SL群体Tajima’D值和Fu’s Fs值为负值，但Tajima’D值不存在显赫性各别(P>0.05)，二者核苷酸错配分散图均呈现多峰(图4e， 4f)，证明历史上未发生群体蔓延事件。

图4 　基于线粒体Cyt b基因和D-loop区序列的长麦穗鱼核苷酸错配分散图a. 闪里，b. 历口，c. 石台，d. 举座（Cyt b）; e. 闪里，f. 历口，g. 石台，h. 举座（D-loop）. Fig. 4 　Mismatch distribution of Pseudorasbora elongata based on mtDNA Cyt b gene and D-loop region sequencesa. SL， b. LK， c. ST， d. Overall (Cyt b); e. SL， f. LK， g. ST， h. Overall (D-loop). 3　盘考

预计种群的遗传种种性可揭示其发祥与进化历史，亦可反应出其进化后劲。遗传种种性预计是评价种群资源状态以及开展保护使命的进攻基础与依据，高水平的遗传种种反应出种群对环境有较强的稳健才能，受环境压力影响小，该种群越容易延续；相背，遗传种种性水平过低则可能导致种群际遇瓶颈甚而消一火[22-23]。

3.1　长麦穗鱼种群遗传种种性

本预计以mtDNA的Cyt b基因和D-loop区为秀丽对3个长麦穗鱼群体遗传种种性近况伸开了拜谒和预计。通过PCR取得SL、LK、ST 3个长麦穗鱼群体线粒体Cyt b基因和D-loop区同源片断序列，分析裸露序列碱基含量A+T均高于G+C，出现赫然的AT偏倚与反G的偏歧风物，这与已知包括鱼类在内的动物线粒体基因组核苷酸分散不均一情况相一致[12-15，23]。D-loop区序列不编码卵白质，且在mtDNA中进化速度最高，变异通过母系遗传而保留，以此为遗传秀丽取得的单倍型数时时更多。在本预计中，D-loop区序列界说了27个单倍型，高于Cyt b基因秀丽界说的单倍型数(18个)。单倍型种种性指数(Hd)和核苷酸种种性指数(π)是常用来评估物种遗传种种性高下的意见。凭证Grant[24]和Bowen等[25]提议来的分类圭臬(Hd=0.5、π=0.005)，将遗传种种性差异为4种模式。本预计中，长麦穗鱼举座的Hd为0.792 (Cyt b)、0.777 (D-loop)， π为0.01332 (Cyt b)、0.01140 (D-loop)合乎上述高单倍型种种性和低核苷酸种种性的模式。由于核苷酸种种性的鸠合比单倍型更漫长，估计合乎该遗传种种性模式的种群可能资格了瓶颈效应或建群效应后蔓延，同期又无弥散本领去鸠合核苷酸变异[24-25]。ST群体长麦穗鱼Hd为0.275 (Cyt b)、0.053 (D-loop)， π为0.00038 (Cyt b)、0.00017 (D-loop)，均远低于上述差异圭臬。这一成果标明ST群体遗传种种性处于较低水平，该群体极有可能遭受过瓶颈效应，亦或是基础群体较小，遗传种种性仅有单一或少量数群体形成，这也反应出ST群体资源量严重枯竭的近况。此外，本预计发现基于D-loop区序列取得的遗传变异数及遗传种种性指数均低于Cyt b基因的成果。一般情况下，D-loop区进化速度快，取得的种群的遗传变异时时大于Cyt b基因，但赵亮等[26]的预计种也发现的mtDNA戒指区的变异速度低于Cyt b基因。综上，关于长麦穗鱼遗传种种性近况应加强其保护力度，遵循增多其资源量，以提升其遗传种种性水平，幸免长麦穗鱼种质资源进一步衰竭。

3.2　长麦穗鱼种群的遗传结构与遗传分化

不同物种间或同种不同种群间的遗传各别进度时时用遗传距离来量度。本预计中3个长麦穗鱼群体间的遗传距离为0.00173~0.03615 (Cyt b)、0.00193~0.02639 (D-loop)，相较而言，SL和LK群体间的遗传距离较小，ST群体与SL及LK间的遗传距离均较大，这与其地舆分散神志相一致。基于Shaklee等[27]提议的鱼类在属(0.9)、种(0.3)、种群(0.05)三级水平上的差异依据，本预计3个长麦穗鱼群体未达到种群差异圭臬(群体间的遗传距离均小于0.05)，证明3个群体可能由兼并祖宗种群扩散形成。鱼类因地舆遮掩或在兼并水域中栖息环境不同而杀青种群的基因疏通，这是种群分化的进攻原因，并由此呈现出与其分散水系相吻合的遗传分化神志[28]。遗传分化指数Fst是评估遗传分化进度的进攻意见，在实质预计中，凭证Wright的分类圭臬：当0<Fst<0.05时，标明群体间遗传各别很小；0.05<Fst<0.15，标明群体间遗传分化达到中等进度水平；0.15<Fst<0.25，标明存在较大的遗传分化；Fst>0.25，则遗传分化很大[28-29]。本预计中SL和LK群体间Fst为0.10688 (Cyt b)、0.05332 (D-loop)，处于中等进度的遗传分化；而ST和LK及ST和LK群体间的Fst值均大于0.9，标明该群体间呈现高度遗传分化神志。此外，基因流亦然评估种群遗传结构和遗传分化的进攻意见，本预计中SL和LK群体间的基因流Nm值大于1；而ST和SL及ST和LK群体间的Nm值均远远小于1。预计以为，Nm<1则标明群体间遗传分化较大；Nm>1标明群体间地舆距离很近或有某种渠谈不错进行基因疏通，群体间的遗传分化较小；Nm>4则证明群体间个体不错立地交配[30-31]。分子方差分析AMOVA成果裸露长麦穗鱼群体间的遗传变异高达90%以上，证明群体间的变异是长麦穗鱼遗传变异的主要开头。综上，酿成3个长麦穗鱼群体呈现上述遗传分化神志的原因与其分散的水系密切关连，SL和LK群体同属于阊江上游支流，有基因疏通的契机；而ST群体分散于秋浦河，由于水系的遮掩杀青了ST群体与其他两个群体间的基因疏通，从而与其他群体间发生了赫然的遗传分化。

基于Cyt b基因和D-loop区序列界说的单倍型构建了ML系统进化树。从系统进化角度来看，3个长麦穗鱼群体形成了两个赫然的地舆聚群：一支由SL和LK群体单倍型组成且这两个群体单倍型彼此夹杂未形成赫然的系统进化关系；另一支由ST群体的单倍型组成且与其他2个群体不分享，标明ST群体与SL和LK群体不毛基因疏通，形成了赫然的地舆遗传结构，这与上述遗传分化神志成果相一致。此外，单倍型Hap2 (Cyt b)、Hap1 (D-loop)均为SL和LK群体的上风单倍型且在辘集结构图中处于中心位置，辘集结构图呈现出的单倍型地舆分散神志与ML系统进化树成果一致。本预计中，值得从容的是本预计系统进化标明长麦穗鱼和同属的麦穗鱼亲缘关系较远，反而与扁吻鮈属的扁吻鮈亲缘关系更近(图2)。长麦穗鱼在样式上与扁吻鮈有相似特征，如二者体型均近似圆筒状，而同属的麦穗鱼体型侧扁；长麦穗鱼和扁吻鮈体侧自吻端沿侧线至尾鳍有玄色纵纹，而麦穗鱼则无此特征[1]。因此，建议后续对长麦穗鱼的系统进化可作念进一步真切预计。

3.3　长麦穗鱼种群的历史动态与保护

利用核苷酸错配分散图与中性覆按估计种群是否资格过蔓延事件。若Tajima’D和Fu’s Fs呈现负值，且具备统计学意旨，则标明该种群显赫偏离中性覆按模子，反应出种群历史上可能资格过蔓延事件[32]。此外，若核苷酸错配分散图呈现泊松分散的单峰，则标明种群可能资格了种群蔓延事件[33]。本预计中核苷酸错配分散图及中性覆按成果标明长麦穗鱼举座历史上近期未发生过赫然的群体蔓延。但ST群体的核苷酸错配分散图呈现单峰，Tajima’D和Fu’s Fs覆按存在显赫性各别，偏离中性进化假定，证明ST群体历史上可能资格过种群蔓延事件大致近期遭受了瓶颈效应。

预计鱼类的遗传种种性近况、遗传结构与谱系地舆神志可为鱼类保护战略及渔业束缚圭表的制定提供参考。长麦穗鱼是我国私有的袖珍鱼类幼女白丝，连年来受环境变化及东谈主为身分的影响，其野生资源量不时下跌。本预计发现长江中卑劣安徽境内长麦穗鱼遗传种种性总体较为丰富，但各群体内的遗传种种性相对较为短少，3个群体呈现出2个主要的谱系关系。其中，ST群体的遗传种种性最低，且其遗传距离、遗传分化指数等均与其他两个群体存在一定进度的遮掩。凭证进化显赫单元(evolutionarily significant unit， ESU)诱惑的原则[34]，建议将长麦穗鱼ST群体看成一个保护束缚单元进行优先保护，SL和LK群体看成一个举座进行束缚和保护，加强对长麦穗鱼种质资源遗传种种性的监测，恒久跟踪其变化，当令地制定科学合理的保护和利用圭表以保证其资源的可捏续性发展。

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